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信帆生物分享:ELISA技術(shù)測定單克隆抗體效價方法

更新時間:2016-03-30      瀏覽次數(shù):1515

信帆生物分享:ELISA技術(shù)測定單克隆抗體效價方法

一、實驗?zāi)康?/p>

1.深入了解elisa 法測定抗體效價的原理。

2.掌握ELISA 法測定單克隆抗體效價的方法。

二、實驗原理

ELISA 是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ),將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標記在抗體/抗原分子上,形成酶標抗體/酶標抗原,稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反應(yīng)后,作用于底物使之呈色,根據(jù)顏色的有無和深淺,定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術(shù)的一種,其特點是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體,使之固相化,免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進行。在每次反應(yīng)后都要反復(fù)洗滌,這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系,也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中.酶促反應(yīng)只進行一次,而抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進行一次或數(shù)次,即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應(yīng)。

目前常用的幾種ELISA 方法有:測定抗體的間接法,測定抗原的雙抗體夾心法和測定抗原的競爭法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體效價。其主要過程為:首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板的凹孔內(nèi),加待測抗體,保溫后洗滌以除去未結(jié)合的雜蛋白質(zhì),加酶標抗抗體,保溫后洗滌,加底物保溫30分鐘后,加酸或堿終止酶促反應(yīng),用目測或光電比色測定抗體含量。

三、儀器、原料和試劑

儀器

聚苯乙烯96孔酶標板、微量移液管、酶聯(lián)免疫閱讀儀、水浴鍋。

原料

單克隆抗體

試劑

1. 抗原及酶標記抗體

①抗原:兔抗人IgG(Rabbit Aanti-human IgG,Code No.A0423);

②酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP(Rabbit Anti-mouse IgG-HRP,Code No.P0260);均為

DAKO 公司產(chǎn)品,使用時按照說明書要求稀釋。

4. 洗滌液(含0.05%Tween 20的PBS):1LPBS 中加入Tween-20 500μL。

5. 封閉液(含1%牛血清白蛋白,0.1%Tween 20的PBS):10mLPBS 中加入100mgBSA,10μLTween-20。

6. 底物溶液

①磷酸鈉鹽緩沖液(0.1mol/LpH6.0):稱Na2HPO4·12H2O2.2g,NaH2PO4·2H2O 6.84g,用蒸餾水溶解,定容至500mL。

② TMB 貯液:稱60mgTMB 溶于10mL 二甲基亞砜中,4℃避光保存。

③底物應(yīng)用液:現(xiàn)用現(xiàn)配,磷酸鈉緩沖液10mL,TNB 貯液10μL。30%H2O2 15μL,混勻。

7. 終止液:2mol/LH2SO4

四、操作步驟

①抗原包被:兔抗人IgG 作為抗原,用包被液l:8000稀釋,100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板

中。4℃放置過一夜

②洗滌:次日傾去凹孔內(nèi)的液體,洗滌液洗3次。

③封閉:加l00μL/孔封閉液,室溫放置0.5h。

④洗滌:用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗):將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另—塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1:2或1:10),100μL /孔加到已包被的板上,每個樣品平行做兩份,PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照,已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育1~2h。

⑥洗滌:用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗抗體:兔抗鼠IgG-HRP,用封閉液l :8000稀釋,100μL/孔,加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌:用洗滌液洗5次,蒸餾水洗2次。

⑨顯色:加新鮮配制的底物溶液100μL/孔,室溫暗處放置5~30min,顯示藍色。

⑩終止反應(yīng)、比色:加50μL/孔終止液.顏色變黃;用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值,陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測樣品的效價。

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